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   1.한국에서의 광범위 내성결핵 ; 위험인자 및 치료결과
 

Soo Hee Hwang1, Hyung Seok Kang2, Seonyeong Min2, Jinhong Min1, Boyoung Jin2, Hye eun Park2, Ayoung Park2, HyeMi Park2, Lisa C. Goldfeder3, Eunhwa Kang2, Hyeyoung Lee6, Seok Yong Eum2, Jongseok Lee2, Ye Jin Lee2, Eunjin Cho2, Hyun Kyung Kwak2, Yonghyun Kim2, Ji Im Lee2, Doo Soo Jeon1, Jin Hee Kim2, Steven M. Holland3, Matthew Carroll3, Seung Kyu Park1,2, Sang Nae Cho5, Clifton E. Barry III3 Laura E. Via3

1, Masan National Tuberculosis Hospital; 2, International Tuberculosis Research Center; 3, National Institutes of Health; 4, Yonsei University at Wonju; 5, Yonsei University College of Medicine.
 
 

대한민국은 선진국 중 결핵유병율(0.07%)이 높은 나라 중 하나이며 다제내성결핵의 비율은 다양하게 추정되고 있다(2-15%). 미국의 국립알레르기및감염병연구소(NIAID)는 한국의 보건복지부와 함께 국립마산결핵병원에 임상연구 수행 장소를 세우기 위하여 공동으로 노력하고 있다. 국립마산결핵병원은 결핵 전원 병원으로서 입원 및 외래 환자 진료를 통해 치료하기 어려운 결핵을 치료하고 있다. 여기 제시된 자료들은 “다제내성 폐결핵 환자의 자연 경과 연구(연구계획서 05-I-N069)”의 사전 결과이다. 이 연구는 4개 코호트에 피험자를 모집하고 있다.: A) 초치료 환자 B) 이전 결핵 치료력을 가진 환자 C) 건강자원군 4) 결핵 완치 환자.
이 연구는 피험자의 의무기록과 함께 재발 혹은 치료 종결 후 2년까지의 경과를 연계하여 결핵 균주의 표현형 및 유전형적 특성과 숙주의 특성을 규명함을 목적으로 한다. 가장 현저한 발견은 이전 결핵 치료력이 있는 환자에서 광범위내성결핵의 유병율이 높다(>40%)는 것이다. 치료 기간이 광범위내성결핵의 위험인자로 판명되었다. 또한 플루로퀴놀론계 항생제에 대한 내성이 초치료군(cohort A 43%)과 재치료군(cohort B 70%) 모두에서 매우 높게 발견되었다. 광범위한 플루로퀴놀론계 항생제에 대한 내성은 한국의 보건 관리에 큰 재앙이라 할 수 있는데 왜냐하면 1차약제(INH, RIR, EMB, and PZA)에 내성을 획득한 균주에선 이 약제가 가장 효과적인 약제이기 때문이다. 이들 균주에 대한 rpoB와 gyrA 유전자의 유전학적 분석과 함께 phylogenic mapping 분석 결과, 광범위내성 균주는 일부 균주의 단순한 유행성 발병(outbreak)이 아니라 다른 많은 균주, 특히 베이징계열 균주에서 각각 광범위내성으로 진화되었다고 나타났다.

 
 
 
 

Figure. Drug resistance of isolates from patients in Cohort A (newly diagnosed) and Cohort B (previously treated). A. the percentage of isolates resistant to the individual agent (or combination of agents). B. National Masan Tuberculosis Hospital in Masan South Korea

CY Jeon, SH Hwang, JH Min, DR Prevots, LC Goldfeder, HY Lee, SY Eum, DS Jeon, HS Kang, JH Kim, BJ Kim, DY Kim, SM Holland, SK Park, SN Cho, CE Barry III, LE Via. Extensively drug-resistant tuberculosis in South Korea: risk factors and treatment outcomes among patients at a tertiary referral hospital Clin Infect Dis 46(1): 42-9. 2008.

CY Jeon, SH Hwang, JH Min, DR Prevots, LC Goldfeder, HY Lee, SY Eum, DS Jeon, HS Kang, JH Kim, BJ Kim, DY Kim, SM Holland, SK Park, SN Cho, CE Barry III, LE Via. Prevalence of XDR-TB Isolates among Retreatment Tuberculosis Cases in a Tertiary Care Hospital in Masan, South Korea. US-Japan Joint Tuberculosis/Leprosy Conference. Zhangzhou China. Sept 9-12, 2007.

LE Via, CY Jeon, SH Hwang, DR Prevots, LC Goldfeder, HY Lee, SY Eum, JH Min, DS Jeon, HS Kang, DY Kim, BJ Kim, SM Holland, SK Park, SN Cho, CE Barry III. High Prevalence of XDR-TB Isolates among Retreatment Tuberculosis Cases in a Tertiary Care Hospital in Masan, South Korea. NIH Symposium on Biodefense and Emerging Pathogens. May 24-25 2007

 
 
 
   2.다제내성결핵환에서 메트로니다졸을 이용한 이중맹검 위약대조 제 2상 임상시험
 

Doo Soo Jeon1, Seonyeong Min2, Myungsun Lee2, Soo Hee Hwang1, Boyoung Jin2, Hye eun Park2, HyeMi Park2, Lisa C. Goldfeder3, Eunhwa Kang2, Seok Yong Eum2, Min Sun Hong2, Jongseok Lee2, Ye Jin Lee2, Eunjin Cho2, Hyun Kyung Kwak2, Ji Im Lee2, Ken Olivier3, Nilo Avila3, Veronique Dartois5, Anne Goh5, Marcus Wenk6, Anne Bendt6, Dean Follmann3, Pamela Shaw3, Matthew Carroll3, Seung Kyu Park1,2, Sang Nae Cho4, Laura E. Via3, Clifton E. Barry III3

1, Masan National Tuberculosis Hospital; 2, International Tuberculosis Research Center; 3, National Institutes of Health; 4, Yonsei University College of Medicine; 5, Novartis Institute for Tropical Diseases; 6, National University of Singapore.
 
 

메트로니다졸은 쥐를 제외한 동물 실험에서 결핵균에 대해 강력한 효과를 보여주는 혐기성 세균에 특이적으로 작용하는 약제이다. 결핵 병소가 혐기적이다라는 가설을 검증하기 위하여, 다제내성결핵의 치료 약제에 메트로니다졸을 병용 투여하여 그 효과를 평가하는 임상 연구를 시작하였다. 이 연구는 고해상도전산화단층촬영(HRCT)과 FDG-양전자방출단층촬영 (FDG-PET) 검사를 이용하여 치료 반응을 모니터하고 병용 투여된 메트로니다졸의 효과를 정량적으로 평가한다. 현재까지 약 30명의 피험자가 이 연구에 참가하고 있다. 우리는 FDG-PET을 통해 많은 결핵 병소가 대사적으로 매우 활성을 가지며 이러한 신호는 항결핵치료에 반응하여 매우 빠르게 변화함을 알게 되었다. 이는 FDG-PET이 치료의 조기 반응을 평가하는데 매우 유용한 대리 지표(surrogate marker)가 될 수 있음을 시사한다. 또한 ELISPOT 반응 역시 치료에 대한 임상반응과 매우 잘 연관된다는 사실을 알게 되었다. 아직 메트로니다졸이 좋은 효과를 보인다고 말하기엔 이르지만, 국제결핵연구센터(ITRC)가 항결핵치료에 대한 조기 반응을 평가하는 대리인자(surrogate marker) 연구에 새로운 분야를 개척하고 있음은 명확하다고 할 수 있다.

 
 
 

Figure. FDG-PET/CT scan of a patient enrolled in the metronidazole clinical trial showing differential response of two lesions in the same patient.

 
 
 
   3.활동성 폐결핵환자에서 호중구의 역할
 

Seok-Yong Eum1*, Ji-Hye Kong1, Min-Sun Hong1, Ye-Jin Lee1, Jin-Hee Kim2, Sang-Nae Cho3, Laura E. Via4 and Clifton E. Barry III4

1, International Tuberculosis Research Center; 2, National Masan Tuberculosis Hospital; 3, Yonsei University College of Medicine; 4, National Institutes of Health.

 
 

결핵균은 세포내에 기생하는 세균으로 주로 대식구 내에서 거주 한다고 알려져 있으나 실지로 이제 대한 직접적인 증거는 아직 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 활동성 폐결핵환자로부터 얻어진 세 가지의 검체 즉, 객담, 폐기관지 세척액, 그리고 수술환자의 폐절제 조직에서의 동공 내용물을 가지고 실제적으로 결핵균이 어디에 위치하고 있는지를 조사해 보았다. 결과로 호중구가 대식구보다 더 많은 숫자가 발견되었는데 객담에서는 86.6 ± 2.2 % vs 8.4 ± 1.3 % 그리고 폐기관지세척액에서는 78.8 ± 5.8 % vs 11.8 ± 4.1 % 였다. 동공에서는 임파구가 41.3 ± 11.2 % 로 가장 많은 수치였고 그다음이 호중구 (38.8 ± 9.4 %) 그리고 대식구 (19.5 ± 7.5 %) 순 이었다. 결핵균을 탐식하고 있는 세포의 수치도 호중구가 대식구보다 훨씬 높았는데 각각 보면 객담 (67.6 ± 5.6 % vs 25.2 ± 6.5 %), 폐기관지세척액 (65.1 ± 14.4 % vs 28.3 ± 11.6 %) 그리고 동공(61.8 ± 13.3 % vs 23.9 ± 9.3 %)으로 검체별로 비슷한 양상을 보였다. 결핵균의 길이도 측정이 되었는데 동공에서 1.9 ± 0.1 mm로 가장 짧았고 객담 (2.9 ± 0.1 mm) 그리고 폐기관지세척액 (3.6 ± 0.2 mm) 순 이었다. 시험관내에서 호중구의 결핵균에 대한 살상효과를 알아보기 위해 환자와 정상인의 말초혈에서 호중구를 분리하여 실험한 결과 살상효과는 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과로 볼 때 호중구는 결핵의 진행과정에서 매우 중요한 역할을 하고 있을 것으로 생각되며 특히 결핵균의 증식을 위한 자리제공 그리고 결핵균의 운반에도 관여할 것이라 사료된다.

 
 
 

Figure 3. Localization of M. tuberculosis bacilli in sputum, in BAL, and in cavity caseum. Cytospin slides were prepared and stained by the Ziehl-Neelsen method followed by Hemacolor® staining. The number of bacilli was counted both inside and outside of the cells in more than 100 fields (x 1000, magnification) under light microscope and the total number ranged between 5 - 855 bacilli. The percentage of extra- and intracellular bacilli was calculated and represented as extracellular (bacilli in extracellular space) and intracellular (bacilli in intracellular space). Horizontal bars indicate mean value. The data among groups were analyzed using one-way analysis of variance and the differences between two groups were tested using the unpaired t test and a P value less than 0.05 was considered significant.

 
 
 
   4.결핵특이항원 인터페론 진단키트 (QuantiFERON-Gold)를 이용한 결핵 노출에 대한 감염 위험도의 평가
 

Seok -Yong Eum1,3, Ye - Jin Lee1, Hyun - Kyung Kwak1, Jin-Hong Min2, Laura E. Via4, Clifton E. Barry III4, Sang-Nae Cho3

1International Tuberculosis Research Center, 2National Masan Tuberculosis Hospital, 3Yonsei University College of Medicine; 4National Institutes of Health.

 
 

본 연구에서는 최근 새로 개발된 결핵감염 진단 키트 (QuantiFERON)의 유용성에 대해서 알아 보았다. QuantiFERON은 결핵균 특이 항원인 “The early secretory antigenic target 6 (ESAT-6)” 그리고 “culture filtrate protein 10 (CFP-10)” 그리고 여기에다 “a portion of the TB antigen TB7.7”을 섞어서 만든 고 감도의 진단 키트로 효과 검증을 위해 기존에 사용되어 온 항원인 PPD와 그 결과를 비교해 보았다. 이를 위해 세개의 시험 그룹이 선정되었는데 저위험군 (의과대학생)과 고위험군 (결핵병원 간호사)의 건강군 그리고 환자군을 대상으로 하였다. 결과는 환자군에서 QuantiFERON® (79.2 %) 그리고 PPD (83.3 %) 의 양성율을 보여 큰차이가 없었으나 저위험군에서는 10.4 % 의QuantiFERON® 그리고 74.1 %의 PPD (p<0.0001) 양성율을 보여 현격한 차이를 보였다. 고위험군에서는 52 % (QuantiFERON)와 68 % (PPD) (p = 0.38)를 보였다. 고위험군인 간호사 그룹에서 결핵노출 기간 (근무기간)과 인터페론 분비량을 비교해본 결과 QuantiFERON에서 유효한 상관관계를 보였다. 이처럼 PPD와 달리 QuantiFERON은 저위험도 및 고위험도군간의 진단에 있어서 분명한 차이를 보여주었는데 이런 결과로 보아 QuantiFERON은 잠복감염에 있어서 유용한 진단법이라 사료된다.

 
 
 

Correlation of IFN-g production in response to PPD or to QuantiFERON in high risk subjects

Eum, S., Y J Lee, H K Kwak, J H Min, S H Hwang, LE Via, CE Barry, 3rd and S N Cho. Evaluation of the diagnostic utility of a whole-blood interferon-gamma assay for determining the risk of exposure to Mycobacterium tuberculosis in Bacille Calmette-Guerin (BCG)-vaccinated individuals. Diagn Microbiol Infect Dis 61(2): 181-186. 2008.

 
 
 
   5.기니픽, 토끼 그리고 영장류 결핵모델에서 보이는 결핵결절의 저산소증
 

Laura E. Via,1 P. Ling Lin,2 Seok Yong Eum,3 Taegwon Oh6, Jinhee Kim4, Taeksun Song6, Edwin Klein,2 Jacqueline Gonzales,1 Eun Gae Lee,1 Seung Kyu Park,3,4 James A. Raleigh,5 Sang Nae Cho,6 JoAnne L. Flynn,2 and Clifton E. Barry III1

1, National Institutes of Health; 2, University of Pittsburgh School of Medicine; 3, International Tuberculosis Research Center; 4, National Masan Tuberculosis Hospital; 5, University of North Carolina School of Medicine; 6, Yonsei University College of Medicine.
 
 

결핵균이 생존하고 있는 장소에 대한 환경적인 특성 연구 및 대사과정에 대한 이해는 약물투여기간을 단축할 수 있는 중요한 연구대상이라고 할 수 있다. Pimonidazole hydrochloride (Hypoxyprobe TM)는 포유류 조직에서 저산소 상태를 알 수 있게 해주는 영상매개체인데 본 연구에서는 이 물질을 사용하여 기니픽, 토끼 그리고 영장류 결핵모델의 결핵 결절에서의 산소농도를 측정해 보고자 하였다. 결핵에 감염된 동물에 pimonidazole을 투여 한 후 폐 조직을 면역화학법으로 염색했을 때 granuloma의 건락괴사 부위 주변으로 양성을 보였다. 이와 같은 현상은 동물을 다시 95% O2 산소방에 넣었을 때 감소되었다. 외과적 방법을 통하여 토끼에서 fiber-optic oxygen probe를 granuloma에 직접 끼워서 산소압을 측정한 결과 작은 결절 (3 mm)에서도 1.6 ± 0.7 mmHg의 높은 산소압을 나타냈다. 마지막으로 시험관내 저산소 상태에서 높은 살균효과를 보여주는 약제인 metronidazole을 토끼에 투여 했을 때 감염 세균수를 현저하게 떨어뜨렸다. 이와 같은 결과는 결핵병변에서 저산소상태가 중요하다는 가설을 뒷받침 해준다고 할 수 있다.

 
 
 

Figure 1. Larger animal models of tuberculosis show hypoxia in lung granulomas. A, The proportion of lesions that are casious and PIM+ in each animal model of TB. B. Immunohistology of PIM staining, indicating hypoxic areas within granulomas. C. In vivo oxygen concentrations within granulomas in the Rabbit lung.

Via, L. E., P. L. Lin, S. M. Ray, J. Carrillo, S. S. Allen, S. Y. Eum, K. Taylor, E. Klein, U. Manjunatha, J. Gonzales, E. G. Lee, S. K. Park, J. A. Raleigh, S. N. Cho, D. N. McMurray, J. L. Flynn and C. E. Barry, 3rd. Tuberculous granulomas are hypoxic in guinea pigs, rabbits, and nonhuman primates. Infect Immun 76(6): 2333-40. 2008

Via, LE, PL Lin, M Roserio, SM Ray, SS Allen, SY Eum, TG Oh, TS Song, JH Kim, EG Lee, E Klein, J Gonzales, SK Park, JA Raleigh, SN Cho, DN McMurray, JL Flynn and CE Barry, 3rd. Hypoxic Microenvironments in Animal Models of Tuberculosis Novatis Institute of Topical Medicine symposium on Tuberculosis, Bagamoyo, Tanzania, 5-10 October 2006

 
 
 
   6.집중 치료를 받은 다제내성 결핵환자군에서의 aminoglycosides와 capreomycin간의 교차내성
 

Laura E. Via1, Soohee Hwang2, Hyong Seok Kang2, Hyeeun Bang4, Yeun Kim4, Taegwon Oh5, Song A Lee3, Seokyong Eum3, Hyun Kyung Kwack3, Eun Jin Cho3, Seonyoung Min3, Vignesh Rajan1, Isdore Chola Shamputa1, Matthew Carroll1, YoungMi Kim6, Seung Kyu Park2,3, Hyeyoung Lee4, Sang Nae Cho5, Clifton E Barry III1.

1, National Institutes of Health; 2, National Masan Tuberculosis Hospital; 3, International Tuberculosis Research Center; 4, Yonsei University, Wonju; 5, Yonsei University College of Medicine.

 
 

2004년에 한국에서 검출된 11,939개의 결핵균주들 중 10.5% (n=1,298)가 다제내성 균주로 보고되었다. 이들 중 15% (n=200)가 광범위약제내성균주 (XDR)로 밝혀지면서 한국은 세계에서도 XDR의 빈도가 가장 높은 지역 중의 하나로 알려지게 되었다. 기술력이 고도로 발전된 한국에서 아직도 결핵 처방은 시행착오라는 오래된 방법에 따라 이루어지고 있는 실정이다. 문제를 더 복잡하게 만드는 점은 고체배지에 기반을 둔 약제감수성검사가 종종 믿을 수 없고 심지어는 동일한 실험실내에서조차 결과가 수시로 변한다는 점이다. 분자 약제감수성검사 결과의 예측가능성을 연구하기 위해 aminoglycosides와 capreomycin에 대한 phenotypic DST 결과를 알고있는 108개의 결핵분리균주를 선정하여 이 들 약제에 대한 저항성에 관련되어 있다고 생각되어지는 유전자들(rrs, rpsL, tlyA, and gidB). 에 대한 염기서열을 결정하였다. 예상했던 대로 kanamycin/amikacin 내성에 관계하는 주 대립유전자는 rrs1401G로, 또 이 대립유전자는Capreomycin와의 교차내성에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. Streptomycin의 내성에 관여하는 주 대립유전자 또한 예상했던 것과 마찬가지로 rpsL128G 였다. 추가로 streptomycin 내성에 관련된 16S rRNA의 530 psudoknot 내에서 수 개의 고유한 돌연변이들을 발견했으며, 또한 알려진 내성관련 부위에 아무런 분자적 손상이 없는 분리균주들도 확인할 수 있었다. tlyA 유전자에서는 극소수의 돌연변이만이 발견되었는데 이것은 한국에서는 capreomycin이 널리 사용되지 않았었기 때문으로 여겨진다. 이런 결과로 볼 때, 일반적으로 사용되는 aminoglycosides에 내성을 보이는 환자들 중 소수의 사람들만이 (1/19) capreomycin에 여전히 감수성을 보이는 것으로 생각되며 대부분의 한국 환자에서 aminoglycoside 내성은 분자 DST로 정확하게 예측할 수 있을 것으로 생각된다.

 
 
 

Figure. Cross resistance of isolates to aminoglycosides and among isolates with a A1401G mutation A. Phenotypic drug resistance of isolates diagramed to depict overlapping resistance pattern with any mutation profile. Numbers represent the percentage of isolates with resistance combination shown within the overlapping circles. B. Phenotypic drug resistance among isolates with this mutation in the 1401 region.

 
 
 
   7.임상에서 분리한 다제내성 결핵균의 빠른 검출을 위한 역교잡 분석법
 

Hyeeun Bang,1 Jooyoung Choi,2 Joohwan Hwang,1 Sangjung Park, 1 Hyeyoung Wang,2 Yeun Kim,2 Eunjin Cho,3 Seung Kyu Park4, Dae Yoon Kim,4 Taeksun Song,5 Laura E.Via,7 Clifton E. Barry, 3rd,7 Sang Nae Cho,6 and Hyeyoung Lee1.

1College of Health Sciences, Yonsei University, Wonju, 2M&D, Wonju,. 3International Tuberculosis Research Center, 4Masan National Tuberculosis Hospital, 5Yonsei University College of Medicine, 6Yonsei University College of Medicine, and 7National Institutes of Health

 
 

한국에서의 결핵 발생률은 결핵 제어 프로그램에 의해 성공적으로 줄어 들고 있는 추세이다. 반면, 다제내성 (MDR) 결핵의 발생 수는 증가하고 있다. 다제내성이란 적어도 INH와 RIF 두 약제에 대해 내성을 가지는 것을 의미하며, 이러한 다제내성 결핵은 치료에 많은 어려움이 있다.
따라서, MDR의 빠른 진단은 MDR-TB환자의 치료와 MDR-TB의 전파를 방지하는데 있어 굉장히 중요하다. 결핵균의 약제 내성과 관련된 유전적 메커니즘의 이해 증가로 결핵균의 약제 내성과 관련된 유전자의 돌연변이 관찰을 위한 보다 빠른 분자적 방법이 많은 발전을 거듭해왔다. 이러한 많은 연구에 따르면, INH 약제 내성과 관련하여 10-15%가 oxyR-ahpC intergenic region의 돌연변이와 관련이 있다고 알려져 있다. 이 연구에서는 한국의 결핵병원에서 분리한 207개의 균주를 이용하여, 새로운 역교잡 분석법인 REBA MDRTB-Tag (한국, 엠앤디) 으로 유전자 rpoB, katG, inhA promoter 뿐만 아니라, oxy-ahpC intergenic region의 돌연변이까지 관찰하였다. 그리고 이 결과는 유전자 염기서열 분석 (sequencing)으로 검증하였다. 검증 결과, REBA MDRTB-Tag은 염기서열 분석법과 비교했을 때 아주 높은 민감도와 특이도를 보였다 (민감도 : 98.5%, 특이도 : 100%)
다른 상품화된 kit (91.6%, 즉 98균주) 이용했을 때 보다 REBA MDRTB-Tag (100%, 즉 107균주) 를 사용했을 때 MDR-TB의 관찰률이 더 증가했다. 또한 이 방법은 smear 양성인 객담에 대해서도 직접적으로 실험이 가능하여 Agar 배지를 기본으로 하는 약제 감수성 검사보다 많게는 3-4주 정도 빠른 약제 내성 결과를 알 수 있어 치료에 보다 빠른 결과를 제공할 수 있다. fluoroquinolone계열의 결핵 치료제 또한 이 REBA 방법을 이용하여 약제 내성검사가 가능하며 이 약의 내성은 gyrA라는 유전자의 돌연변이가 관여하는데 이 실험 또한 평가 진행 중에 있다.

 
 
 

Figure. A, Comparison of REBA MDR-TB with sequencing of M. tuberculosis INH or RFP-resistant isolates
and both drugs-susceptible clinical isolates. B. Genotype pattern of M. tuberculosis clinical isolates in REBA MDRTB-Tag. Targeted genes and specified probes representing INH- and RFP-resistance associated sequences are shown from up to down. Genotype pattern of each strain be shown with colorimetric detection on membrane strip. Lane1: rpoB 531TTG mutant strain, Lane 2: rpoB 516TAC mutant strain, Lane 3: katG 315ACC mutant strain, Lane 4: inhA promoter region 15UPS C→T mutant strain, Lane 5: oxyR-ahpC intergenic region -39 C→T mutant strain, Lane 6: H37Rv M. tuberculosis type strain. WT: wild type, M: mutant type.

 
 
 
   8.한국의 3차 결핵병원에서 분리한 약제 감수성 결핵균과 광범위약제내성 결핵균주의 유전적 다양성
 

Isdore Chola Shamputa1, Jongseok Lee2, Caroline Allix-Beguec3, Jin Hong Min4, Lisa C. Goldfeder1, Jin Hee Kim4, Hyung Seok Kang4, Soo Hee Hwang4, Seok Yong Eum2, Hyeyoung Lee5, Seung Kyu Park2,4, Philip Supply6, Sang Nae Cho7, Laura E. Via1, Clifton E. Barry III1

1National Institutes of Health; 2International Tuberculosis Research Center, 3Genoscreen, Lille, France, 4Masan National Tuberculosis Hospital; 5Yonsei University, Wonju; 6Institut Pasteur de Lille/Institut de Biologie de Lille; and 7Yonsei University College of Medicine

 
 

결핵균에 대한 유전형 분석연구는 결핵 전파에 있어서의 역학적 정보를 제공하거나, 결핵균의 유전형질 분포 또는 확산을 산출할 때, 결핵의 급격한 발생 또는 이와 유사한 정도의 증가를 연구하는 분야와 더불어 실험실 교차 오염을 확인하는데 큰 기여를 해왔다. 그러나 한국에서는 결핵의 분자 역학분야에 관한 정보는 한정되어 있었다. 이 연구에서는 기존에 한국의 국립마산결핵병원에서 실행중인 전향적 관찰 연구에 참여하고 있던 환자들로부터 분리한 208개의 결핵균의 유전적 다양성과 약제내성양상을 Spoligotyping, IS6110-RFLP 및 MIRU-VNTR등의 기법을 이용해 확인하였다. 약제감수성 결과를 알고있는 202개의 균주들 중 61개는 모든 약제에 대해 감수성이 있었으며, 31개는 한 개의 약제에 대해 내성을, 44개는 여러 개의 약제에 대해 내성을 가지고는 있었으나 MDR의 범주에는 들지 않았고, 59개는 MDR, 20개는 광범위하게 약제에 대한 내성을 가지고 있었다. Spoligotyping 결과로는 202 (97.1%)개의 균주가 Beijing 유전형을 가지고 있는 것으로 결과가 도출되었고, MIRU-VNTR법으로는 71개의 균주가 25개의 서로 다른 무리로 분류되어, 분류정도가 34%에 불과하여 결핵 전파를 알아보기에는 충분하지 못했다. 162개의 구분되는 양상을 보이는 것들에 대해 Allelic diversity를 확인해본 결과 0.0에서 0.7에 이르는 낮거나 일반적인 수준을 보이고 있었다. Single locus variant (SLV) analysis 결과 2163b (11) 위치에서 가장 높은 SLV 가 나타났고, 그 다음으로는 2996 (6), 2165 (5), 960 (4) 들이 그 뒤를 이었다. 이런 결과들로 볼 때, Spoligotyping은 분리균을 구분하는데 한계가 있었고, 24개의 부위를 대상으로하는 MIRU-VNTR 은 대부분의 균주들을 구분하는데 충분한 것으로 나타났다. 분류된 각 집단들은 역학적으로는 연관성이 없을 수도 있을 것으로 생각되며, 한국에 확산되어있는 균주들의 계통발생적 분지와 연관이 있는 것으로 생각된다. 이 연구결과는 염색체 염기서열결정을 위해 계통발생학적으로 쌍을 이루는 약제 내성 및 감수성균주를 선택하는데도 사용되었으며, 질병의 심각한 정도와 관련해서 phenolic glycolipid 발현 등과 같은 독성결정인자의 역할을 평가하는데 사용되고 있다.

 
 
 
 

Poster presented at the Novartis Institute of Tropical Diseases symposium on tuberculosis in Maputo, Mozambique from September 8-12, 2008.

 
 
 
   9.Waveguide-based optical biosensor를 사용한 환자소변으로부터의 민감도높은 결핵 특이적 표지검출법
 

Harshini Mukundan1, Jessica Kubicek1, Dominique Price1, Aaron Anderson1, Jennifer Martinez1, Kevin Grace1, Seok Yong Eum2, Seung Kyu Park 2,3 Soo Hee Hwang3, Ye Jin Lee2, Jin Hye Kong2, Seonyeong Min2, Hyungseok Kang3, Sang Nae Cho4 Laura E.Via5, Clifton Barry III5 and Basil.I. Swanson1

1, Los Alamos National Laboratory; 2, International Tuberculosis Research Center; 3, National Masan Tuberculosis Hospital; 4, Yonsei University College of Medicine; 5,National Institutes of Health.

 
 

결핵의 초기진단에 세균의 바이오센서를 사용하는 것은 그 표지물질 발현에 대한 적절한 정보가 부족하거나 검출을 위한 효과적인 수단이 부족한 등의 이유로 제약이 있었다. Los Alamos National Laboratory 의 바이오센서 연구팀은 결핵균에 특이적인 리포아라비노만난, 항원85, ESAT 6등의 바이오마커들의 검출법을 waveguide-based optical biosensor를 이용하여 개발하였다. 이것은 편평한 optical waveguide 표면의 기능화된 표면위에서 대상 항원을 연구하는 sandwich immunoassay법이다. 기능화된 특별한 표면에 추가로 waveguides를 이용함으로써, 표준면역검사법으로는 얻을 수 없었던 특별한 특이성과 민감도를 얻을 수 있었다. 최근, 약제 감수성 또는 다재내성 균주들로 고통받는 환자의 소변으로부터 빠른 (15분) 감수성 (pM 감수성)과 특이성 (낮은 비 특이적 background와 인접한 antigen간의 교차-반작용)을 가지는 lipoarabinomannan (15 test중 14 sample (14/15))과 antigen 85 (6/15)을 검출하는 분석법을 개발하였다. 또한 변형된 immunoblot 분석법을 사용함으로써 환자 소변에서 ESAT-6 (12/15)와 alpha-crystallin (1/15)의 존재도 관찰하였다. 현재는 소변으로부터 적절한 바이오마커를 정량적이면서 민감도 높게 검출하면서 여러 개 시료를 동시에 처리할 수있도록 개량하고 있는 중이다. 이런 분석법은 민감도 높은 연구수단으로서, 또 독성인자를 추적하거나 약제 중단 결정, 결핵의 신속한 검출을 위한 가능성 높은 진단법이 될 것으로 기대하고있다

 
 
 
 

FIGURE: A. Prototype multichannel waveguide assembled in a flow cell holder. In this photo, A, B and C represent the three flow channels. Each channel has four gratings etched longitudinally across the waveguide surface. B. A prototype Antigen 85 assay on the Waveguide-based Optical Biosensor. C. Lower non-specific binding achieved with better labeling and surfaces in the prototype LAM assay.

H Mukundan, SM Ray, SY Eum, J Martinez, K Grace, K Grace, SK Park, SN Cho, LE Via, CE Barry III and BI Swanson. Waveguide-based Optical Biosensor for Detection of Tuberculosis-Specific Antigens in Patient Urine. Keystone Meeting on Tuberculosis, Vancouver, British Columbia, March 20-25 2007.

H Mukundan, J Kubicek, D Price, A Anderson, J Martinez, K Grace, SN Cho, SY Eum, SH Hwang, SK Park, LE Via, CE Barry III and BI Swanson. Sensitive Detection of Tuberculosis-Specific Markers in Patient Urine using a Waveguide-based Optical Biosensor. Immunodiagnostics of TB: New Questions, New Tools. Sept 21-23 2008, Virginia Beach VA USA

 
 
 
   10.분자 비콘을 이용한 플루오르퀴놀론 약제내성 검출
 

Jongseok Lee1, Eunjin Cho1, Younghyun Kim1, Bola Aladegbami2, Laura E. Via3, Matthew Carroll3, Eungae Lee5, Seung Kyu Park4, Sang Nae Cho5, Hyeyoung Lee6, Soumitesh Chakravorty2, Clifton E. Barry III3, David Alland2

1, International Tuberculosis Research Center; 2, University of Medicine and Dentistry of New Jersey; 3, National Institutes of Health; 4, National Masan Tuberculosis Hospital; 5, Yonsei University College of Medicine; 6, Yonsei University, Wonju.

 
 

전통적인 방법을 이용하여 환자의 검체로부터 결핵균을 분리, 동정하고 약제내성을 검사하기 위해서는 수 주일 이상의 시간이 소요된다. 결핵균의 약제내성 획득은 보통의 경우 몇 가지 한정된 유전자에서 점돌연변이가 발생하는 것에 기인하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 결핵균에서 RNA polymerase β-subunit (rpoB)의 한정된 부위에 일어난 돌연변이가 대부분의 리팜핀 내성을 유발시키고, gyrase A-subunit (gyrA)에 발생한 돌연변이는 플루오르퀴놀론 내성과 밀접하게 연관되어 있는 것과 같은 경우이다. 현재 국제결핵연구센터에서는 일반 비콘을 이용하여 gyrA 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법과 함께, 새롭게 개발중인 mismatch-tolerant “Sloppy” 분자 비콘 (SMB)을 이용한 gyrA 유전자의 점돌연변이 검출 연구를 진행 중에 있다. gyrA 비콘은 gyrA 유전자상의 내성결정부위에 있는 21bp를 두 개의 비콘이 검출하도록 고안되었다. 검출대상부위는 비대칭 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다. 이 연구에서는 전통적인 평판배양법을 이용한 약제 감수성결과와 분자생물학적 기법인 역교잡법을 이용한 결과 모두를 이용할 수 있는, 현재 진행중인 자연경과연구에 포함된 균주들을 사용하여 플루오르퀴놀론 비콘의 유용성을 검증하였다. 일반 비콘은 REBA assay와 비교했을 때 민감도는 100%, 특이도는 97%를 보였으나 10개 시료에서 플루오르퀴놀론 내성균이 섞여있는 경우는 검출하지 못했다. 이 점을 보완하기 위해 melting temperature (Tm)-shift를 이용한 검증법을 도입하였다. 이를 위해 야생형 또는 특정 돌연변이 염기서열을 확인할 수 있는 SMB를 제작하였다. 이를 인공적으로 제작한 PCR 주형에 적용하여 본 결과, 기존에 퀴놀론 내성에 관계한다고 알려진 4개 코돈에 걸쳐있는 9개의 gyrA 돌연변이를 확인할 수 있었다. 또한 29개의 임상분리 결핵균을 대상으로 하였을 때도 4개의 내성. 감수성 혼합균주 감염을 포함한 17개의 플루오르퀴놀론 내성 균주를 정확하게 확인할 수 있었다. 비콘을 이용함으로써 퀴놀론 내성 결핵균을 real-time PCR format을 사용하여 대량으로, 또 간단하고 빠르게 하나의 시험으로 검출하는 것이 가능할 것이다. 비콘법을 rpoB나 다른 내성 표적에 사용하면 광범위약제내성 결핵균(XDR-TB)을 하루 내에 검출할 수 있게 될 것이다.

 
 
 

Figure. Summary of conventional reverse blot hybridization blot (REBA) results as compared with standard mutation-detecting beacon and comparison of conventional versus asymmetric PCR. A. The performance of the REBA and Beacon assays is being compared to the actual sequence of ~500 initial patient isolates. There are some differences in detection under investigation. B. PCR at various primer ratios are shown as indicated. Note: primer ratios of 1:10 and 1:20 are optimal in this particular assay, as they generate very strong endpoint fluorescence with minimal change in CT value compared to conventional PCR.

 B Aladegbami, EG Lee, LE Via, H Safi, D Helb, SK Park, HY Lee, SN Cho, CE Barry III, D Alland and S Chakravorty. “Detection of Rifampin and Fluoroquinolone resistance inducing mutations by using the Tm shift of Sloppy Molecular Beacons” Northeast Biodefense Center Conference, 20-21 October 2007.

B Aladegbami, EG Lee, LE Via , H Safi, D Helb, SK Park, HY Lee, SN Cho, CE Barry III, D Alland, S Chakravorty. “Detection of rpoB and gyrA Mutations Inducing Resistance using Sloppy Molecular Beacons.” 6th ASM Biodefense and Emerging Diseases Research Meeting, February 24-27 2008
 
 
 
 
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